برای تعیین راندمان بهینه استخراج پلیساکارید گیاه هفت کول، ۱۷ آزمون با اعمال شرایطی که با بهره گرفتن از آزمونهای Single-factor و توسط نرمافزار دیزاین اکسپرت پیشنهاد شده بود انجام شد (به جزئیات این آزمونها در فصل چهارم به تفصیل پرداخته شده است) .
( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )
درصد راندمان استخراج پلی ساکارید با بهره گرفتن از معادله ۳-۱ محاسبه گردید ( لی[۱۱۵] و همکاران، ۲۰۱۳):
(معادله ۳-۱) ۱۰۰ × ) WDR/ (WDP = Extraction yield%
WDP = وزن خشک پلیساکارید
WDR = وزن خشک ماده خام
۳-۵ آزمونهای شیمیایی
۳-۵-۱ آزمون تعیین قدرت مهار رادیکال دی.پی.پی.اچ
در سال ۱۹۹۲رادیکال آزاد DPPH توسط گلداشمیت[۱۱۶] و رن[۱۱۷] کشف شد و به عنوان استاندارد و رنگسنج در فرایندهای اکسیداسیون (تعیین خواص آنتیاکسیدانی عصارههای گیاهی، ویتامینها و…) مورد استفاده قرار گرفت. دلیل این استفاده گسترده را میتوان به نگهداری نامحدود آن بدون اینکه تجزیه شود و یا با اکسیژن واکنش دهد، نسبت داد. ۲و۲-دی فنیل-۱-پیکریل هیدرازیل (DPPH) یک ماده چربی دوست بوده و در آب نامحلول است. محلول DPPH مانند پرمنگناتپتاسیم بنفش رنگ است، که با احیاء شدن توسط عناصر دهنده الکترون یا هیدروژن به دیفنیلپیکریلهیدرازین با رنگ نارنجی متمایل به زرد تبدیل می شود (آیونیتا[۱۱۸]، ۲۰۰۳). و در نتیجه جذب آن کاهش مییابد. قابلیت اهداء الکترون یا اتم هیدروژن در اسانس ها و برخی ترکیبات خالص را بوسیله محلول متانولی ۲و۲-دی فنیل-۱-پیکریل هیدرازیل بنفش رنگ اندازه گیری میکنیم. درجه بیرنگ شدن این ترکیب در حضور ماده مورد آزمون، نشانگر میزان پتانسیل ضداکسایشی آن میباشد و هرچه این مقدار بیشتر باشد فعالیت ضد اکسایشی ماده مورد نظر در جذب و حذف رادیکالهای آزاد بیشتر است.
تعیین قدرت مهار رادیکال DPPH پلیساکارید گیاه هفتکول بر اساس روش شین[۱۱۹] و همکاران ( ۲۰۱۴) و سانگام[۱۲۰] و همکاران (۲۰۱۴)، با اندکی تغییر به صورتی که در ادامه توضیح داده می شود، انجام شد. به طور خلاصه ۵۰ میکرولیتر از محلول پلیساکارید در متانول (با غلظتهای ۲، ۴، ۶، ۸ و ۱۰ میلیگرم بر میلیلیتر) به ۵ میلیلیتر از محلول DPPH (%004/0 محلول متانولی) افزوده شد. بعد از ۳۰ دقیقه گرمخانه گذاری در دمای اتاق و نگهداری در محل تاریک، میزان جذب نمونهها در ۳ تکرار در طول موج ۵۱۷ نانومتر خوانده شد.
شکل ۳-۱ ساختار رادیکال آزاد DPPH (آیونیتا، ۲۰۰۳)
این جذب بیانگر مقدار DPPH باقی مانده (احیاء نشده) است که بعد از ۳۰ دقیقه اندازه گیری می شود. از فرمول زیر (معادله ۳-۲) میزان فعالیت آنتی اکسیدانی (مهار رادیکالهای آزاد) محاسبه شد (فن و همکاران، ۲۰۱۰):
(معادله ۳-۲)
Scavenging activity % = (Absblank _ Abssample)/Absblank × ۱۰۰
Absblank =میزان جذب در نمونه شاهد یا کنترلی (حاوی تمامی ترکیبات به جز ترکیب مورد آزمون)
Abssample = میزان جذب در ترکیبات مورد آزمون
این آزمون به صورت یاد شده در غلظتهای ۸، ۱۲، ۱۶ و ۲۰ میلیگرم بر میلیلیتر برای فراکسیونهای پلیساکارید نیز به انجام رسید.
۳-۵-۲ آزمون تعیین قدرت مهار رادیکال هیدروکسیل
مخلوط واکنشی شامل پلیساکارید با غلظتهای ۲، ۴، ۶، ۸ و ۱۰ میلیگرم بر میلیلیتر در آب مقطر، که با ۱ میلیلیتر فنانترولین ( mmol/L5/2)، ۱ میلیلیتر فروس سولفات ( mmol/L5/2)، ۱ میلیلیتر آب مقطر، ۱ میلیلیتر پراکسید هیدروژن (mmol/L 20)، و بافر فسفات ( Mm20 ؛ ۴/۷ = pH)، در ۳ تکرار تهیه شد و در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت ۹۰ دقیقه گرمخانه گذاری شد و جذب آن در طول موج ۵۳۶ نانومتر توسط اسپکتروفتومتر خوانده شد که آن را با A1 نشان میدهیم. محلول واکنش دیگری با همین ترکیب ساخته شد، تنها با این تفاوت که پراکسید هیدروژن با آب مقطر جایگزین گردید. جذب این محلول را با A2 نشان میدهیم و مخلوط دیگری مشابه فوق تهیه می شود که در آن پراکسید هیدروژن با محلول پلیساکارید جایگزین گردید و جذب آن با A3 نشان داده شده است (سان[۱۲۱] و همکاران، ۲۰۰۹).
توانایی مهار رادیکال هیدروکسیل بوسیله معادله ۳-۳ محاسبه گردید (سان و همکاران، ۲۰۰۹):
معادله ۳-۳
Scavenging effect (%) = (A3 − A1)/ (A2 − A1) × ۱۰۰
این آزمون به صورت یاد شده در غلظتهای ۸، ۱۲، ۱۶ و ۲۰ میلیگرم بر میلیلیتر برای فراکسیونهای پلیساکارید نیز به انجام رسید.
۳-۶ آزمونهای میکروبی
۳-۶-۱ فعالسازی گونههای میکروبی
گونه های لیوفیلیزه باکتریایی در محیط کشت Tripticase soy broth کشت داده شد و به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری شد. همچنین گونه های مخمر و کپک مورد آزمون در محیط کشت سابورات دکستروز براث[۱۲۲] کشت داده شده و به مدت ۴۸ ساعت در دمای ۲۸ درجه سانتی گراد نگهداری شدند. یک روز قبل از انجام آزمون باکتری ها در محیط BHI[123] و دو روز قبل از آزمون کپکها و مخمرها در محیط سابورات دکستروز آگار پاساژ داده شدند.
۳-۶-۲ آزمون آنتیبیوگرام به روش انتشار دیسک:
تست آنتی بیوگرام شامل سنجش میزان توانایی یک آنتی بیوتیک و یا سایر عوامل ضد میکروبی برای ممانعت از رشد باکتری ها در آزمایشگاه میباشد، این توانایی را میتوان با بهره گرفتن از روشهای رقت سازی در لوله و یا کشت میکروارگانیسم در پلیت اندازه گیری نمود (ادلند[۱۲۴] و همکاران، ۲۰۰۰).
آزمون آنتیبیوگرام، طبق روش زی و همکاران (۲۰۱۲) در آزمایشگاه میکروبیولوژی، به صورتی که خواهیم خواند، انجام داده شد.
ابتدا محیط کشتهای مولر هینتون آگار (برای گونه های باکتریایی)، YGC[125] آگار( برای گونه های مخمری) و سابوراتدکستروز آگار (برای گونه های کپکی) به میزان کافی تهیه شده و در اتوکلاو استریل گردید و قبل از ریختن درون پتریدیشهای ۷۰ میلیمتری تا دمای ۵۰-۴۵ درجه سانتی گراد سرد شد. برای تهیه سوسپانسیونهای باکتریایی با میزان کدورت استاندارد، محلول ۵/۰ مک فارلند (cfu/ml 108×۵/۱) استفاده شد. برای این منظور، جذب سوسپانسیون باکتری ها در محلول سرم فیزیولوژی در طول موج ۶۲۵ نانومتر، باید بین ۱/۰- ۰۸/۰ باشد. سپس ۱۰۰ میکرولیتر از سوسپانسیونهای تهیه شده بر سطح پلیتها ریخته شده و با بهره گرفتن از لوپ به طور کامل بر سطح پلیت پخش گردید. دیسکهای استریل شده (کاغذ واتمن شماره ۱، با قطر ۶ میلیمتر و ضخامت ۱ میلیمتر) بر سطح پلیتها قرار داده شد و سپس حجم ۱۰۰ میکرولیتر از سوسپانسیونهای پلیساکاریدی در سطوح غلظت ۴، ۸، ۱۲، ۱۶ و ۲۰ میلیگرم بر میلیلیتر، بر روی دیسک تزریق شد. سپس پلیتهای مربوط به باکتری ها، به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد و کپکها و مخمرها در ۲۸ درجه سانتی گراد در همین مدت زمان، گرمخانهگذاری شدند. در پایان، قطر منطقه بازداری[۱۲۶] اندازه گیری شده و بر حسب میلیمتر گزارش شد. برای هر سطح غلظت، آزمونها در ۳ تکرار به انجام رسید.
همچنین این آزمون در غلظتهای ۸، ۱۲، ۱۶ و ۲۰ میلیگرم بر میلیلیتر برای فراکسیونهای پلیساکارید نیز انجام داده شد.
۳-۷ روشهای شناسایی خصوصیات ساختاری پلیساکارید
۳-۷-۱ شناسایی قندهای سازنده پلیساکارید با بهره گرفتن از کروماتوگرافی گازی
ترکیب مونوساکاریدی پلیساکارید هفتکول با بهره گرفتن از کروماتوگرافی گازی به این صورت انجام شد که ۳۰ میلیگرم از نمونه پلیساکارید در ۲ میلیلیتر محلول تری فلورواستیک اسید (TFA[127]) (mol/ml 2) حل شد و به مدت ۳ ساعت در دمای ۱۲۰ درجه سانتی گراد انکوبهگذاری شد (زو[۱۲۸] همکاران، ۲۰۱۵). بعد از اینکه باقیمانده تری فلورواستیک اسید تحت خلاء در دمای ۴۰ درجه سانتی گراد خارج شد، ماده هیدرولیز شده با متانول تغلیظ و خشک گردید. سپس با افزودن مخلوطی از متانول، پیریدین و انهیدرید استیک، استیله شد. ۶ محلول قندی استاندارد (گزیلوز، آرابینوز، مانوز، رامنوز، گالاکتوز و گلوکز) نیز به همین صورت استیله شدند (زیانگ[۱۲۹] و همکاران، ۲۰۱۴). هر محلول به طور جداگانه توسط GC مجهز به آشکارساز FID[۱۳۰] و ستون موئینه[۱۳۱] سیلیکا (RTX-1701) آنالیز شد. دمای ستون از ۱۸۰ تا ۲۲۰ درجه سانتی گراد با سرعت ◦C/min 5 افزایش یافت. سپس در ◦C220 به مدت ۵ دقیقه باقی ماند و باز با سرعت ◦C/min 10 به ◦C 280 رسید و به مدت ۲۰ دقیقه در این دما نگهداشته شد. دمای آشکار ساز و Injector در ◦C 280 تنظیم شد. گاز نیتروژن با خلوص بالا به عنوان گاز حامل استفاده شد (زو و همکاران، ۲۰۱۵). سرعت گاز حامل در ml/min 25 تنظیم گردید (زیانگ و همکاران، ۲۰۱۴).
۳-۷-۲ شناسایی خصوصیات ساختاری پلیساکارید استخراج شده با روش تبدیل فوریه مادون قرمز
شناسایی ساختار پلیساکارید استخراج شده از گیاه هفتکول با بهره گرفتن از دستگاه تبدیل فوریه مادون قرمز (FTIR)، به این صورت انجام شد که ۱ میلیگرم پلیساکارید با ۳۰۰ میلیگرم نمک برومیدپتاسیم آسیاب شده، فشرده گردیده و به صورت یک دیسک جهت انتقال به طیف سنج مادون قرمز آماده شد (گوا[۱۳۲] و همکاران، ۲۰۱۰). سپس طیف مادون قرمز تبدیل فوریه با قدرت تفکیک (۱- Cm4) و میانگین ۳۰ اسکن در دقیقه در دامنه فرکانس ۱- Cm4000-400 به دست آمد (یانگ[۱۳۳] و همکاران، ۲۰۱۱).
فصل چهارم
نتایج و بحث
فصل چهارم
نتایج و بحث
۴-۱ بررسی اثر متغیرها بر راندمان استخراج پلیساکارید گیاه هفتکول
در این مرحله آزمونهایی تحت عنوان Single test study به منظور انتخاب دامنه متغیرهای مورد بررسی، بر راندمان استخراج پلیساکارید، انجام گرفت که در ادامه به آنها پرداخته خواهد شد.
۴-۱-۱ بررسی اثر متغیر دما بر راندمان استخراج پلیساکارید
دما یک فاکتور موثر بر راندمان استخراج پلیساکارید میباشد (یه و جیانگ[۱۳۴]، ۲۰۱۱). در این مرحله اثر دماهای مختلف (۴۰، ۷۰ و ۹۰ درجه سانتی گراد) بر راندمان استخراج پلیساکارید برگ گیاه هفتکول (VLLP) به طوری مورد بررسی قرار گرفت که دیگر متغیرها ثابت اعمال شدند (زمان آزمون: ۴۵ دقیقه، نسبت آب به ماده خام ۳۵ میلیلیتر بر گرم). همانطور که در نمودار ۴-۱ دیده می شود، راندمان استخراج VLLP در دامنه دمایی ۹۰-۴۰ درجه سانتی گراد صعودی بوده (در فاصله دمایی ۴۰ تا ۷۰ درجه سانتی گراد با شیب کم و در فاصله ۷۰ تا ۹۰ درجه سانتی گراد با شیب زیاد افزایش دیده می شود) و در ۹۰ درجه سانتی گراد به بالاترین میزان خود (۱۲%) رسیده است. این افزایش راندمان بر اثر دما را میتوان متأثر از کاهش ویسکوزیته، بهبود عملکرد حلال و افزایش ضریب انتشار ماده حل شونده دانست که سبب افزایش انحلال پلیساکارید در محلول (زاینس[۱۳۵] و همکاران، ۲۰۱۱) و افزایش انتقال جرم (یه و جیانگ، ۲۰۱۱) میگردد و تغییر ناگهانی شیب نمودار در دمای ◦C70 به طور کاملاً مشخصی نشان دهنده مناسب بودن این دما، برای شکسته شدن پیوندهای موجود در ماتریکس ترکیب مورد نظر میباشد (زاینس و همکاران، ۲۰۱۱ ). در پژوهشی که توسط شن و همکاران (۲۰۱۴) بر روی پلیساکارید گیاه پاریس پلیفیلا انجام شد، افزایش دما از ۶۰ به ۹۰ درجه سانتی گراد سبب افزایش راندمان گردید. همچنین سانگام و همکاران (۲۰۱۴) اثر دماهای مختلف را بر راندمان استخراج پلیساکارید از گیاه سیمبوپوگان سیتراتوس[۱۳۶] مورد بررسی قرار دادند و به این نتیجه رسیدند که افزایش دما از ۵۰ به ۱۰۰ درجه سانتی گراد، موجب افزایش راندمان میگردد که نتایج این محققان با نتایج به دست آمده در این تحقیق مطابقت داشته و بر این اساس، دامنه دمایی ◦C 90-50 برای این پژوهش انتخاب گردید.
نمودار۴-۱ اثر دما بر راندمان استخراج پلیساکارید برگ گیاه هفتکول
۴-۱-۲ بررسی اثر متغیر زمان بر راندمان استخراج پلیساکارید
زمان، دیگر فاکتور مؤثر بر استخراج پلیساکارید میباشد (شن و همکاران، ۲۰۱۴). اما از سویی دیگر، افزایش بیش از حد زمان، می تواند باعث تغییر در ساختار مولکول پلیساکارید گشته و کاهش راندمان استخراج را در پی داشته باشد (کای[۱۳۷] و همکاران، ۲۰۰۸). در این بخش، زمان استخراج متغیر (۱۵، ۴۵ و۷۰ دقیقه)، و دما و نسبت آب به ماده خام، ثابت (دما: ۷۰ درجه سانتی گراد و نسبت آب به ماده خام: ۳۵ میلیلیتر بر گرم) در نظر گرفته شد. همانگونه که در نمودار ۴-۲ قابل مشاهده است، راندمان استخراج پلیساکارید در طول زمان با شیبی ثابت افزایش یافته است (مطابق با نتایج اسکیلسون[۱۳۸]، ۲۰۰۲). مطالعه لی و همکاران (۲۰۱۳) بر بروگیورا جیمورایزا [۱۳۹] نشان داد افزایش زمان استخراج در دامنه زمانی ۱۰ تا ۵۰ دقیقه، سبب افزایش راندمان استخراج گردیده که با پژوهش حاضر مطابقت دارد. همچنین نتایج پژوهش سمواتی[۱۴۰] (۲۰۱۳) در مطالعه ای که بر پوشش هیدروکلوئیدی گیاه بامیه انجام داد افزایش درصد استخراج را تحت تأثیر افزایش زمان نشان داده است، به این ترتیب که راندمان استخراج در فاصله زمانی ۳۰ تا ۹۰ دقیقه روند افزایشی داشته (در ۹۰ دقیقه به بیشترین حد خود رسیده) و در زمانهای بالاتر با کاهش مواجه گشته است. از سویی نتایج پژوهش لیو و همکاران (۲۰۱۳) بر گیاه لایسیوم روتنیکوم[۱۴۱]، که استخراج پلیساکارید را تحت سه متغیر زمان، نسبت آب به ماده خام و قدرت مایکروویو مورد بررسی قرار دادند، حاکی از آن بود که راندمان استخراج پلی ساکارید در دامنه زمانی ۵ تا ۲۵ دقیقه روند افزایشی، و در زمانهای بیشتر، روند کاهشی داشته است که این نتیجه با نتایج بهدست آمده در این پژوهش تطابق نداشته و علت آن را میتوان به تخریب و هیدرولیز پلیساکارید بر اثر کاویتاسیون و افزایش بالای دمای ناشی از امواج مایکروویو نسبت داد (سان[۱۴۲] و همکاران، ۲۰۱۰). با توجه به نمودار ۴-۲، دامنه زمانی ۷۰-۲۰ دقیقه برای این پژوهش در نظر گرفته شد.
نمودار ۴-۲ اثر زمان بر راندمان استخراج پلیساکارید برگ گیاه هفتکول
۴-۱-۳ بررسی اثر متغیر نسبت آب به ماده خام بر راندمان استخراج پلیساکارید
فاکتور موثر دیگری که بر راندمان استخراج پلی ساکارید موثر است، نسبت آب به ماده خام میباشد (گاوندر[۱۴۳] وهمکاران، ۲۰۰۵؛ یه و جیانگ، ۲۰۱۱؛ تهموزی و قدسی[۱۴۴]، ۲۰۱۴). از این رو این فاکتور به عنوان یکی از متغیرها مورد بررسی قرار گرفت. در ابتدا استخراج در نسبتهای مختلف آب به ماده خام (۱۵، ۳۵ و ۵۵ میلیلیتر بر گرم) به صورتی انجام شد که دیگر فاکتورها ثابت اعمال شدند (دما : ۷۰ درجه سانتی گراد و زمان ۴۵ دقیقه). همانطور که در نمودار ۴-۳ مشاهده میگردد در فاصله نسبتهای ۵ تا ۳۵ میلیلیتر بر گرم، راندمان استخراج تقریباً ثابت بوده و در فاصله ۳۵ تا ۵۵ میلیلیتر بر گرم افزایش محسوسی داشته است. اثر افزایش نسبت آب به ماده خام بر استخراج پلیساکارید را میتوان به افزایش نیروی محرکه ناشی از افزایش حلال نسبت داد (لیو، ۲۰۱۳؛ سانگام، ۲۰۱۴). نتایج مطالعه تهموزی (۲۰۱۴) بر گیاه گلگاوزبان[۱۴۵] نشان داد در شرایطی که متغیرهای دما، زمان و قدرت مایکروویو ثابت بودند با افزایش نسبت آب به ماده خام از ۱۰ به ۷۰ میلیلیتر بر گرم، راندمان استخراج پلیساکارید افزایش یافته و در بیش از این مقدار، کاهش راندمان را در پی داشته است. این در حالی است که ژائو (۲۰۱۳) در بررسی اثر متغیر نسبت آب به ماده خام بر راندمان استخراج پلیساکارید، بر گیاه آکانتوپیناکس سنتیکوسس[۱۴۶]، افزایش راندمان استخراج پلیساکارید را همزمان با افزایش نسبت آب به ماده خام از ۱۰ تا ۴۰ میلیلیتر بر گرم، و در بیش از این نسبت کاهش راندمان را با شیبی ملایم گزارش نموده است. ژائو (۲۰۱۳) علت این افزایش و کاهش را به این صورت شرح داد که انتشار سریعتر پلیساکارید در حضور بیشتر حلال باعث حلپذیری مولکولهای پلیساکارید بیشتری گردیده و افزایش راندمان را در پی خواهد داشت اما در نسبتهای بالاتر حلال، احتمال از بین رفتن پارهای از مولکولهای پلیساکارید را در طی فرایند استخراج، عامل کاهش راندمان دانست. لی و همکاران (۲۰۱۳) در بررسی اثر نسبت آب به ماده خام بر استخراج پلی ساکارید از گیاه بروگیورا جیمورایزا، در فاصله نسبت ۱۰ تا ۴۰ میلیلیتر بر گرم، افزایش راندمان استخراج، و در بیش از این میزان، کاهش آن را گزارش کردند. بر اساس نتایج به دست آمده دامنه ۲۰ تا ۵۰ میلیلیتر بر گرم برای متغیر نسبت آب به ماده خام انتخاب شد.
نمودار ۴-۳ اثر نسبت حلال به ماده خام بر راندمان استخراج پلیساکارید برگ گیاه هفتکول
۴-۲ بهینهسازی شرایط استخراج پلیساکارید برگ گیاه هفتکول (VLLP)
هنگامی که عوامل و روابط زیادی بر متغیر پاسخ تأثیر داشته باشند، تحلیل پاسخ سطح (RSM) یکی از ابزارهای موثری است که با کمترین منابع و داده های کمی، و با طرح آزمایشی مناسب، همزمان چندین متغیر را تعیین می کند. به طور کلی، رویه RSM شامل گام های ذیل می باشد (مایرز و همکاران، ۱۹۹۲):
گام ۱. طراحی و انجام آزمایشاتی جهت دستیابی به معیارهای کافی و قابل اطمینان پاسخ مورد نظر.
گام ۲. ایجاد مدلهای ریاضی سطح پاسخ مرتبه اول و دوم با بهترین برازش.
