۱-۳-۲-نقش فسفر در گیاهان
فسفر بعد از نیتروژن و پتاسیم پرمصرف ترین عنصر برای گیاه به شمار می رود. این عنصر در تمام فرآیندهای شیمیایی، ساز و کاراهای انتقال انرژی و انتقال پیام ها دخالت دارد. این عنصر حدود ۵/۰ درصد وزن خشک گیاه را تشکیل داده و جزء اصلی پروتئین ها و اسید های نوکلئیک است. فسفر از اجزای مهم تشکیل دهنده DNA و RNA، فسفرپروتئین ها، فسفولیپیدها، کوآنزیم ها NAD و NADP و مولکول های حامل انرژی ADP و ATP به شمار می رود (شو-ان و همکاران، ۱۹۸۸). با وجود اینکه میزان فسفر کل در خاک های مختلف از ۴۰۰ تا ۱۰۰۰ میلی گرم در کیلوگرم گزارش شده است، ولی گیاهان این عنصر را فقط به صورت آنیون های یک ظرفیتی H₂PO₄ یا دو ظرفیتی HPO₄^2-جذب می کنند. فسفر در توسعه ریشه، تقسیم سلولی، تولید آلبومین، گلدهی، میوه دهی، رسیدگی محصول و افزایش کیفیت گیاه نقش موثری دارد. این عنصر در تشکیل بذر نقش اساسی دارد. همچنین فسفر باعث مقاومت گیاه در برابر ورس، رشد جوانه های جانبی در درختان میوه و در نهایت باعث افزایش عملکرد و کیفیت محصول می شود (آنون، ۱۹۸۳).

۱-۳-۳- ضرورت استفاده از میکروارگانیسم های حل کننده فسفات
دخالت میکروارگانیسم ها در انحلال فسفات های معدنی در دهه اول قرن بیستم شناخته شد و از آن زمان تا حال حاضر مطالعات زیادی در این باره انجام شده است. میکروارگانیسم های حل کننده فسفات در همه جا حضور دارند و تعداد و تنوع جمعیت آنها در خاک های مناطق مختلف متفاوت است. در حدود ۵۰-۱ درصد جمعیت میکروبی یک خاک را باکتری های حل کننده فسفات و در حدود ۵/۰ – ۱/۰ درصد آن را قارچ های حل کننده فسفات تشکیل می دهند. به طور کلی جمعیت باکتری های حل کننده فسفات در یک خاک در حدود ۱۵۰-۲ برابر جمعیت قارچ های حل کننده فسفات می باشد (درزی، ۱۳۸۶).
در بسیاری از خاک های ایران به دلیل بالا بودنpH و فراوانی یون کلسیم، مقدار محلول و قابل جذب برخی عناصر غذایی مانند فسفر، کمتر از مقدار لازم برای تامین رشد مناسب گیاه است، بنابراین گیاه همیشه با کمبود این عنصر مواجه است( راثی پور و علی اصغرزاده، ۱۳۸۶). از مهمترین روش های متداول برای رفع کمبود عناصر غذایی به خصوص فسفر در خاک، استفاده از کودهای شیمیایی و بیولوژیک است. استفاده از کودهای شیمیایی فسفاته به خصوص انواع وارداتی آن باعث آلودگی خاک از نظر کادمیم می شود. به علاوه درصد بالایی از این کودها بعد از ورود به خاک تثبیت شده و عملا برای گیاه غیر قابل استفاده می شود، به طوری که بازده آنها در خاک های آهکی از ۲۰ درصد تجاوز نمی کند (توماس و همکاران، ۱۹۸۵). نتایج تحقیقات نشان می دهد که افزایش مصرف کودهای فسفر، نه تنها عملکرد محصولات زراعی را چندان افزایش نداده بلکه اثر رقابتی با سایر عناصر دارد (باسکوت و وارما، ۲۰۰۵). محققین معتقدند که افزایش بیش از حد فسفر باعث اختلال در جذب آهن و یا بروز علائم کمبود آن می شود. همچنین کلسیم زیاد در خاک های آهکی باعث کاهش فسفر قابل دسترس می شود و یا نیتروژن به طور غیر مستقیم باعث افزایش جذب فسفر توسط گیاه می شود (ملکوتی، ۱۳۷۴).
در حالی که در اکثر کشورهای پیشرفته نسبت مصرف نیتروژن (N)، فسفر (P₂O₅) و پتاسیم (K₂O) به ترتیب ۱۰۰ و ۵۰ و ۴۰ تاست، این نسبت در ایران بسیار نامتعادل و تقریبا ۱۰۰ و ۸۰ و ۵ بوده و همیشه در مصرف کود، بیشتر به کودهای فسفاته توجه شده است (سیلسپور و همکاران، ۱۳۷۹ و ملکوتی، ۱۳۷۴). بنابراین تجدیدنظر در استفاده از کودهای فسفاته و به کار بردن روش های نوین مانند استفاده از کود های زیستی ضروری به نظر می رسد. میکروارگانیسم هایی که باعث افزایش قابلیت جذب فسفر می شوند، ساپروفیت هستند و قادرند در منطقه ریزوسفر فعالیت نموده و با کمک ترشحات ریشه، ترکیبات نامحلول فسفات مانند تری کلسیم فسفات را به صورت محلول و قابل جذب گیاه درآورند (سیلسپور و همکاران، ۱۳۷۹). مهمترین باکتری های حل کننده فسفات به جنس های پسودوموناس و باسیلوس تعلق دارند و از قارچ های حل کننده فسفات، جنس های آسپرژیلوس و پنیسلیوم را می توان نام برد (راثی پور و علی اصغرزاده، ۱۳۸۶).
بقای مایع تلقیح میکروبی در خاک تحت تاثیر عوامل زنده ای چون شکارچی ها و ریشه گیاهان قرار می گیرد و در این میان رشد و نمو گیاهان در عرضه مواد غذایی به این میکروب ها نقش مهمی دارد.
عوامل غیر زنده شامل بافت خاک، pH، دما، مقدار رطوبت و دسترسی به مواد غذایی در خاک ها نیز بقای مایه تلقیح میکروبی را در خاک تحت تاثیر قرار می دهند. عدم دسترسی به مواد غذایی کافی، به عنوان یک عامل غالب در عدم موفقیت کاربرد مایه تلقیح میکروبی در یک خاک به شمار می رود. در اغلب محیط های طبیعی، مقدار اندکی از مواد غذایی برای رشد و نمو این میکروارگانیسم ها وجود دارد. در برخی از تحقیقات مشخص شده که قابلیت بقای میکروارگانیسم های حل کننده فسفات به میزان جمعیت اولیه آنها در مایه تلقیح مصرفی بستگی دارد (درزی، ۱۳۸۶).
۱-۳-۴-مکانیسم عمل کود فسفات بارور ۲
فسفر به صورت ترکیبات آلی و معدنی در خاک وجود دارد. قسمت آلی از بقایای گیاهی، جانوری و میکروبی تشکیل می گردد که شامل فسفولیپیدها، اسید های نوکلئیک و ترکیباتی مثل اسید فیتیک می باشد و مقدار آن به شدت وابسته به تجزیه میکروبی و معدنی شدن مواد آلی است. قسمت معدنی بیشتر شامل ترکیبات حاوی کلسیم، آهن و آلومینیوم است که به اشکال مختلف در طبیعت وجود دارند.
کود زیستی فسفاته بارور ۲ حاوی دو نوع باکتری حل کننده فسفاته از جنس باسیلوس لنتوس (سویه P5) و جنس پسودوموناس پوتیدا (سویه P13) می باشد که جنس باسیلوس با ترشح اسیدهای آلی مانند اسیدهای استیک، پروپیونیک، لاکتیک، گلیکولیک، فوماریک و سوکسینیک، ابتدا باعث کاهش pH به صورت موضعی می شود، سپس با تجزیه پیوند موجود در ساختار ترکیبات فسفاته ی معدنی که به صورت نامحلول در خاک درآمده اند، آنها را به شکل محلول قابل جذب برای ریشه گیاه تبدیل می کند. جنس پسودوموناس با ترشح آنزیم های فسفاتاز باعث تجزیه ترکیبات فسفاته آلی، و در نتیجه معدنی شدن و قابل جذب شدن آنها می شود (باسکوت و وارما، ۲۰۰۵، اوجاقلو، ۱۳۸۶).
۱-۳-۵-نتایج حاصل از کاربرد کودهای زیستی فسفاته
آمار سنجی از ۴۰۰ کشاورز در ۱۰ استان کشور که به کمک طرح ملی گندم انجام شد، نشان داد که مصرف کود زیستی فسفاته، محصول گندم را به طور متوسط ۲/۱۱ درصد افزایش داده است (اوجاقلو، ۱۳۸۶). نتایج حاصل از مصرف کود میکروبی فسفاته در مقایسه با کودهای سوپرفسفات تریپل در مورد ذرتا، سویا و گندم موید اثرات مثبت این کود می باشد، به طوری که کود میکروبی فسفاته نه تنها راندمان جذب کود را بالا می برد، بلکه باعث افزایش قابل توجهی در عملکرد می شود (صالح راستین، ۱۳۸۰). با مصرف کود میکروبی فسفاته به جای کودهای شیمیایی فسفاته در سطح ۷ استان گندم خیز کشور، مشخص شده است که کود فسفاته میکروبی قابلیت رقابت خوب با کود های شیمیایی فسفاته دارد به طوری که میانگین افزایش عملکرد دانه در اثر استفاده از کود فسفاته میکروبی در مقایسه با کود شیمیایی سوپرفسفات تریپل برابر با ۵۷۶ کیلوگرم بوده است (سیلسپور و همکاران، ۱۳۷۹).
مقایسه تلقیح سویا با PSM (میکروارگانیسم های حل کننده فسفات) و کاربرد کود فسفره، حاکی از برتری تیمار PSM در افزایش عملکرد بوده است (کیانی راد، ۱۳۷۴). راثی پور و علی اصغرزاده (۱۳۸۶) گزارش کردند که باکتری های حل کننده فسفات، وزن خشک، درصد فسفر، پتاسیم و نیتروژن بخش هوایی گیاه و وزن تر و وزن خشک گره های ریشه را به طور معنی داری افزایش می دهند. درزی (۱۳۸۶) طی تحقیقی نشان داد که مصرف کود فسفات زیستی در رازیانه اثر معنی داری روی تعداد چتر در بوته، وزن هزاردانه، شاخص برداشت و عملکرد دانه نداشت ولی اثر آن روی ارتفاع بوته و عملکرد بیولوژیک معنی دار بود. راتی و همکاران (۲۰۰۱) بیان کردند که کاربرد چندین سوش از باکتری های حل کننده فسفات، ارتفاع بوته و بیوماس گیاهی را در علف لیمو در مقایسه با شاهد افزایش داد. آنها همچنین گزارش کردند که علاوه بر افزایش وزن خشک گیاه علف لیمو، کیفیت اسانس نیز در اثر مصرف باکتری های حل کننده فسفات بهبود می یابد به طوری که درصد ژرانیول در حدود ۶/۲۷ درصد بیشتر از تیمار شاهد بود. هازاریکا و همکاران (۲۰۰۰) طی تحقیقی نشان دادند که کاربرد باکتری باسیلوس پلی میکسا همراه با سنگ فسفات معدنی، ارتفاع گیاه، بیوماس و درصد همزیستی ریشه و جذب نیتروژن و فسفر را در چای افزایش می دهد.
ریحانی تبار و همکاران (۱۳۸۱) گزارش کردند که تلقیح گندم با سویه های مختلف پسودوموناس فلورسنس، موجب بهبود جذب عناصر غذایی توسط گیاه می گردد. کانتال و همکاران (۲۰۰۷) طی تحقیقی روی گیاه دارویی Stevia rebaudiana Bert نشان دادند که کاربرد باکتری های حل کننده فسفات، سبب بهبود عملکرد بیوماس و میزان جذب عناصر غذایی در این گیاه می شود. محفوظ و شرف (۲۰۰۷) در آزمایشی روی گیاه رازیانه گزارش کردند که بیشترین میزان آنتول در اسانس رازیانه به تیمار تلقیح با باکتری باسیلوس مگاتریوم و مصرف کودهای P , N و K در نصف مقادیر توصیه شده، مربوط بوده است. گن و همکاران (۱۹۹۳) گزارش کردند که در کشت بهاره، تلقیح گوجه فرنگی با باکتری پسودوموناس فلورسنس می تواند قابلیت بازارپسندی و وزن میوه های درجه یک را از ۶/۵ تا ۶/۹ افزایش دهد آنها همچنین نشان دادند که در کشت پاییزه، پسودوموناس فلورسنس عملکرد میوه های قابل فروش را ۳/۱۳ درصد و وزن میوه های درجه یک را ۲/۱۸ درصد افزایش می دهد.
تلقیح چغندر قند با پسودوموناس فلورسنت در شرایط گلخانه، وزن خشک و تر ریشه و بخش های هوایی گیاه را به میزان ۲۰ تا ۲۵ درصد افزایش داد (ریحانی تبار و همکاران، ۱۳۸۱).
۱-۴-کود زیستی نیتروکسین
۱-۴-۱- نقش نیتروژن در گیاهان
نیتروژن به عنوان مهم ترین عنصر در حاصلخیزی خاک، محور اصلی کودهای شیمیایی را تشکیل می دهد. نیتروژن در ساختمان پروتئین، اسید نوکلئیک، کلروفیل، آنزیم ها، فسفاتید و اکثر ویتامین ها و سایر مولکول های آلی که در فرایند تبادل مواد گیاهان نقش موثر و مهمی دارند، وجود دارد (بریمانی، ۱۳۷۶). مقدار نیتروژن در اندام های گیاهی بعد از کربن، اکسیژن و هیدروژن (که گیاه هر سه آنها را زا طریق آب و هوا تامین می کند)، حداکثر و در ماده خشک گیاهی متوسط می باشد و در واقع این عنصر را به عنوان گلوگاه رشد گیاهی می شناسند. نیتروژن در ساختمان RNA و DNA هم وجود دارد (اوجاقلو، ۱۳۸۶).
۱-۴-۲- اهمیت تثبیت بیولوژیکی نیتروژن هوا
نیتروژن مولکولی (N2) جزء اصلی اتمسفر زمین است. با وجود این، سیستم های بیولوژیکی نمی توانند به طور مستقیم N2 را جهت ساختن مواد شیمیایی مورد نیاز برای رشد و تولید مثل به کار ببرند. نیتروژن مولکولی قبل از الحاق به سیستم زنده باید با عنصر هیدروژن ترکیب شود. فرایند احیای N2 که معمولا منجر به تثبیت نیتروژن می گردد، ممکن است به صورت شیمیایی یا بیولوژیکی انجام گردد. نیتروژن به طور مداوم توسط فرآیندهایی مانند نیترات زدایی میکروبی، فرسایش خاک، شستشو، تبخیر شیمیایی و مهم تر از همه برداشت بقایای گیاهی حاوی نیتروژن، از زمین خارج می شود. بنابراین ذخیره نیتروژنی خاک های زراعی باید به طور متناوب جهت حفظ سطح مناسبی از نیتروژن لازم برای تولید محصول، تجدید شود. یکی از راه های اصلی تجدید نیتروژن خاک، فعال شدن سیستم های تثبیت بیولوژیکی نیتروژن (BNF) است. در تثبیت بیولوژیکی، انرژی مورد نیاز برای تثبیت نیتروژنه مولکولی از اکسیداسیون کربوهیدرات ها که حاصل فتوسنتز گیاهان سبز است، تامین می گردد و منشا انرژی مورد نیاز آن نور خورشید است. بنابراین انرژی BNF به طور غیر مستقیم از یک منبع پایان ناپذیر اخذ می شود و این انرژی در هر جا که شرایط اجازه رشد ارگانیسم های فتوسنتز کننده را بدهد، به صورت بالقوه وجود دارد. طبق آمار موجود، در مقیاس جهانی حجم نیتروژن تثبیت شده از طریق BNF، ۱۷۵ میلیون تن در سال می باشد. مقدار نیتروژن تثبیت شده در هر مکانی به شرایط محیطی و ماهیت سیستم های بیولوژیکی برخوردار از قابلیت تثبیت نیتروژن بستگی دارد. این مقدار ممکن است از یک مقدار ناچیز تا چند صد کیلوگرم در هر هکتار در سال متغیر باشد (اوجاقلو، ۱۳۸۶).
۱-۴-۳- روش های بیولوژیکی تثبیت نیتروژن مولکولی هوا
دی آزوتروف ها (میکروارگانیسم هایی که توان تغذیه از نیتروژن مولکولی (N2) را به عنوان تنها منبع نیتروژنی دارند) بر اساس وابستگی به گیاهان به منظور تامین کربن و انرژی لازم برای تثبیت نیتروژن، به سه گروه آزادزی، همیار و همزیست تفکیک می شوند (صالح راستین، ۱۳۸۰).
۱-۴-۴- تثبیت نیتروژن با دی آزوتروف های آزادزی
این موجودات کربن و انرژی لازم برای انجام فرایند تثبیت نیتروژن را به طور مستقل یعنی بدون همکاری با یک گیاه میزبان و اکثرا با روش هنروتروفی (استفاده از مواد کربنی ساده موجود در خاک) و یا فتوتروفی ( با انجام فتوسنتز)، فراهم می کنند. مانند رودوسپریلیوم، کروماتیوم، و سیانوباکترهای فتوسنتز کننده (جلبک های سبز – آبی). باکتری های هتروتروف تثبیت کننده نیتروژن می توانند هوازی، بی هوازی یا اختیاری باشند. این باکتری ها به مقدار زیاد در طبیعت پراکنده شده اند و دو نوع اول سهم زیادی در تثبیت نیتروژن و تعادل آن در اکوسیستم های طبیعی و کشاورزی دارند (حاجی بلند و همکاران، ۱۳۸۳، صالح راستین، ۱۳۸۰).
۱-۴-۵- تثبیت نیتروژن به روش همیاری
این حالت نوعی همزیستی باکتری های دی آزوتروف با گیاهان است که به صورت تماس فیزیکی دو همزیست با هم و بدون تشکیل اندام ساختمانی خاصی برای محدود کردن مکان همزیستی صورت می گیرد. خانواده نیتروژنوباکتراسه و به ویژه جنس نیتروژنوباکتر و آزوسپریلیوم مهمترین باکتری های غیر همزیست و هوازی تثبیت کننده نیتروژن هستند. باکتری های این گروه معمولا در ریزوسفر، روی سطح ریشه آندوریزوسفر یا فضاهای بین سلول های پوست ریشه فعالیت دارند و گاهی اوقات در اندام های درونی گیاه مانند سیستم آوندی ساقه و حتی در بین سلول های برگ نیز مشاهده شده اند. گیاهان میزبان بیشتر به گرامینه ها از جمله گندم، ذرت، برنج، نیشکر، سورگوم و نیز به گونه های علوفه ای و علفی تعلق دارند. این باکتری های تثبیت نیتروژن را معمولا در شرایط میکروایروبیک و با بهره گرفتن از ترکیب های کربنی ساده مانند اسید های آلی و قندها انجام می دهند. ریشه های گیاه با ترشح مواد کربنی مناسب، انجام فعالیت های تنفسی و پایدار نگه داشتن فشار نسبی اکسیژن در اطراف خود، این دو پیش نیاز را برای انجام تثبیت نیتروژن توسط این گروه از باکتری ها فراهم می کنند (صالح راستین، ۱۳۸۰).
نیتروژنوباکترها به دلیل فراوانی و وسعت انتشار، بیش از سایر انواع تثبیت کننده ها مورد توجه قرار گرفته اند و در خاک های مناطق معتدله نیز بیشترین اهمیت را دارند. در خاک های زراعی با زهکشی خوب بیشترین مقدار تثبیت آزاد نیتروژن توسط این باکتری ها انجام می گیرد. نیتروژنوباکترها در زیستگاه هایی مانند خاک، سطح برگ، آب های شیرین و در مناطق مختلف حاره ای و قطبی رشد می کنند. فراوانی نیتروژنوباکترها در خاک های مختلف متفاوت بوده و عمدتاً در خاک های قلیایی تا خنثی دیده می شوند و در خاک های فقیر و اسیدی کمیاب هستند. نیتروژنوباکر ها توانایی ساختن ویتامین ها ی B12, B6, B2, B1، پانتوتنیک اسید و نیکوتنیک اسید را دارا هستند و تولید این ویتامین ها تحت شرایط دی آزوتروفیک و تغذیه کافی کربن افزایش می یابد. همچنین نیتروژنوباکترها قادر به ساختن اسیدهای آمینه و انواع عوامل رشد مانند اکسین، جیبرلین و سیتوکینین هستند (آستارایی و کوچکی، ۱۳۷۵).
نیتروژنوباکتر می تواند از انواع مختلف منابع کربن (مونو، دی و برخی از پلی ساکاریدها)، اسیدهای آلی معطر، اتیل الکل، گلیسرول، بخارهای مانیتول استن و سایر اسیدهای آلی فرار بهره مند شود. برای رشد بهتر نیتروژنوباکتر و توانایی تثبیت نیتروژن، حضور کلسیم در حد اپتیمم مورد تاکید واقع شده است. به همین نحو، حضور مشترک نیتروژن، عناصر کم مصرف و کلرور سدیم در ماده غذایی می تواند در تثبیت نیتروژن توسط نیتروژنوباکتر موثر باشد. گونه نیتروژنوباکتر کروکوکوم آنتی بیوتیک های ضد قارچ تولید می کند که برای انواع قارچ های خاکزی محدود کننده است. در حقیقت، این عمل دوگانه نیتروژنوباکتر نقش مثبت باکتری ها را در جوانه زنی بذر ها آشکار می سازد. نقش اصلی نیتروژنوباکتر در تثبیت نیتروژن است اما توانایی آن در سنتز اکسین ها، ویتامین ها، مواد تحریک کننده رشد و آنتی بیوتیک های ضد قارچی جزو امتیازات دیگر نیتروژنوباکتر محسوب می شود.
نیتروژنوباکتر یک باکتری هوازی است و برای تشکیل ATP اکسیژن لازم است، اما تثبیت نیتروژن یک مرحله غیر هوازی است. در حقیقت، اکسیژن از محل تثبیت نیتروژن باید خارج شود. به این منظور غشاهایی در اطراف نیتروژناز موسوم به شبکه حفاظتی نیتروژناز از طریق بازسازی ساختمان فیزیکی آن ایجاد کرده و لعاب فراوانی در اطراف سلول های خود ترشح می کند، به نحوی که مقاومت نسبی در برابر ورود اکسیژن به داخل سلول ها را فراهم می سازد. در هر حال بسیاری از محققین عقیده دارند که افزایش تنفس توسط نیتروژنوباکتر، اکسیژن را از نیتروژناز دور می کند و این عمل می تواند به عنوان یک ابزار طبیعی در دور کردن اکسیژن از محل تثبیت نیتروژن به خدمت گرفته شود (آستارایی و کوچکی، ۱۳۷۵).
باکتری آزوسپریلیوم به دلیل توان تثبیت نیتروژن مولکولی از طریق همیاری با گیاهان مهم زراعی مانند انواع غلات و همچنین به دلیل تولید هورمون های محرک رشد گیاه به عنوان یک کود بیولوژیک مورد توجه قرار گرفته است. این باکتری علاوه بر پتانسیل بالایی که برای بهبود رشد گیاهان میزبان از خود نشان داده است، به دلایل دیگری مانند وسعت انتشار جغرافیایی، طیف وسیع گیاهان میزبان، تنوعگونه ای و تحمل بعضی از گونه ها به تنش های محیطی مورد توجه قرار گرفته است. از بین گونه های آزوسپریلیوم، دو گونه برازیلنس۱ و لیپوفروم۲ نسبت به سایرین پراکنش بیشتری دارد. گونه برازیلنس بیشتر با غلات سه کربنه و گونه لیپوفروم عمدتاً با غلات چهار کربنه همیاری برقرا می کنند. تلقیح گیاهان با آزوسپریلیوم علاوه بر کاهش مصرف کود نیتروژنه در حدود ۳۰ تا ۳۵ درصد، می تواند سبب بهبود رشد گیاه و افزایش مقدار محصول آن گردد (بادی و دویرینر، ۱۹۸۸). در گیاهان تلقیح شده با آزوسپریلیوم، افزایش تقسیم سلولی در ریشه ها تشدید می شود و معمولاً تغییراتی در مورفولوژی سیستم ریشه ای ایجاد می گردد، به طوری که تعداد و طول ریشه های فرعی، تارهای کشنده و انشعاب آنها افزایش می یابند (اردکانی و همکاران، ۱۳۷۸).
۱-۴-۶- تثبیت نیتروژن به صورت همزیستی
باکتری های ریزوبیوم به طور اختصاصی ریشه های گیاهان خانواده لگومینوز (مانند لوبیا، سویا، شبدر، یونجه، بادام زمینی و …) با درجه میزبانی بسیار بالا را آلوده می سازند. این نوع همزیستی، سالانه ۲۰ درصد تثبیت بیولوژیکی نیتروژن جهان را بر عهده دارد. مقدار نیتروژن تثبیت شده در سال به شکل ترکیبات مختلف، حدود ۷۵ تا ۳۰۰ کیلوگرم در هکتار است (آنون، ۱۹۸۳).
تثبیت همزیستی نیتروژن در گرهک ها اتفاق می افتد. این گرهک ها در پاسخ به آلودگی ریشه به باکتری ها، در ریشه ها تولید می شوند. مواد تراوش یافته از ریشه، این باکتری ها را در منطقه ریشه های مویین به سطح ریشه جذب می کنند. باکتری ها به ریشه مویین در حال ظهور که رشد حلقوی غیر عادی دارند، می پیوندند. یک لوله غشایی به وسیله دستگاه گلژی ساخته می شود، این لوله به درون سلول توسعه می یابد و با غشای سلولی امتزاج پیدا می کند و دیواره سلولی را تجزیه می نماید. باکتری ها در امتداد لوله ای که اکنون رشته تلقیح نامیده می شود، حرکت می کنند باکتری ها به درون آپوپلاست آزاد می شوند و یک رشته تلقیح ثانویه تشکیل می شود که تا عمق کورتکس منشعب می گردد. در نهایت یک سری از کیسه های حاوی باکتری ایجاد می گردد که به وسیله غشا پلاسمایی احاطه شده است و باکترویید نامیده می شود. کیسه های حاوی باکتری، عوامل تقسیم سلولی را به درون سینوسول گیاهی آزاد می کنند. این عوامل باعث تقسیم سلولی به صورت موضعی می شوند که منجر به ایجاد تورم و تشکیل گرهک می گردند، که این گرهک ها مقدار قابل توجهی از نیتروژه را تثبیتمی کنند (احمدی و سی و سه مرده، ۱۳۸۰).
۱-۴-۷- مکانیسم تثبیت زیستی نیتروژن
نیتروژن جوی، مولکولی مرکب از دو اتم نیتروژن است که به وسیله یک پیوند سه گانه خیلی قوی به هم متصل شده اند و مقدار زیادی انرژی برای شکستن این پیوند لازم است. بنابراین مولکول از لحاظ شیمیایی کاملاً غیر فعال است.
واکنش شیمیایی کلی برای تثبیت نیتروژن که به وسیله میکروارگانیسم ها انجام می شود به صورت زیر است:
N2 +8H+ +8E- +16ATP 2NH3 +H2 +16ADP+16Pi
قابلیت سیستم بیولوژیکی در تثبیت نیتروژن به وجود سیستم آنزیمی دی نیتروژناز بستگی دارد و این آنزیم تبدیل N2 به شکل احیا شده را کاتالیز می کند. این واکنش زمانی رخ می دهد که N2 به کمپلکس نیتروژناز متصل شود. پروتئین آهن دار ابتدا به وسیله الکترون داده شده توسط فرودکسین احیا می شود و سپس به ATP متصل می گردد و پروتئین آهن- مولیبدون را احیا می کند. این پروتئین الکترون را به N2 می دهد و HN=NH تولید می کند. در دو سیکل بعدی به صورت H2N-NH2 احیا شده و به ۲NH3 تبدیل می شود.
چون آنزیم نیتروژناز به اکسیژن حساس است، میکروارگانیسم هایی که از نوع هوازی هستند با پایین نگه داشتن سطح اکسیژن در سلول های خود، تولید مقادیر زیادی از پلی ساکاریدهای برون سلولی و نگه داشتن آب درلایه ژلاتینی پلی ساکاری، می توانند انتشار اکسیژن را به سلول ها محدود کنند (تیت، ۱۹۹۵).
۱-۴-۸- مشخصات کود زیستی نیتروکسین
ماده مؤثر: مجموعه ای از باکتریهای تثبیت کننده نیتروژن از جنس نیتروژنوباکتر و آزوسپریلیوم تعداد سلول زنده در هر گرم: ۱۰^۸ سلول زنده از هر یک از جنس های باکتری در هر میلی لیتر نیتروکسین است.
کود بیولوژیک نیتروکسین حاوی مؤثرترین باکتری های تثبیت کننده نیتروژن می باشد که با تایید مراجع تحقیقاتی کشور، توسط موسسه فن آوری زیستی آسیا با برخورداری از بالاترین تکنولوژی و بر اساس استانداردهای بین المللی تولید و عرضه می گردد. باکتریهای موجود در کود بیولوژیک نیتروکسین علاوه بر تثبیت نیتروژن هوا و معادل کردن جذب عناصر اصلی پر مصرف و ریز مغذی مورد نیاز گیاه، با سنتز و ترشح مواد محرک رشد گیاه نظیر هورمون های تنظیم کننده رشد مانند اکسین، ترشح اسیدهای آمینه مختلف، انواع آنتی بیوتیک و سیدروفور موجب رشد و توسعه ریشه و قسمت های هوایی گیاهان می گردد و با حفاظت ریشه گیاهان از حمله عوامل بیماریزای خاکزی، موجب افزایش عملکرد و کیفیت برتر می گردد. مصرف این محصول هنگام بروز تنش های محیطی از جمله شوری و خشکی سبب افزایش مقاومت گیاهان می شود (راویا و همکاران، ۲۰۰۶).
۱-۴-۹- نتایج حاصل از کاربرد کود زیستی نیتروکسین
باسکارا و چاریولو (۲۰۰۵) گزارش کردند که تلقیح ارزن دم رویاهی با سه نژاد باکتری آزوسپریلیوم، به تنهایی یا در ترکیب با کود نیتروژن، طول گیاه، وزن خشک ساقه و ریشه و نیتروژن کل ساقه، ریشه و دانه را افزایش می دهد. بالمی و همکاران (۲۰۰۷) اظهار داشتند که تلقیح بذر پیاز با نژاد CBD-15 باکتری از توباکتر، به افزایش معنی دار رشد و اجزای عملکرد گیاه منجر می شود. حاجی بلند و همکاران (۱۳۸۳) گزارش کردند که نیتروژنوباکترها نه تنها روی افزایش رشد و مقدار کلروفیل در گندم مؤثر هستند، بلکه روی جذب و انتقال عناصر نیز تاثیر مثبتی دارند و این می تواند عناصر کم مصرف را نیز شامل گردد. عمو آقایی و همکاران (۱۳۸۲) گزارش کردند که اثر سویه Do1 باکتری آزوسپریلیوم برازیلنس بر شاخص های رشد، عملکرد و محتوای نیتروژن دانه گندم، بیشتر از سویه Sp7 است. با توجه به اینکه سویه Do1 یک سویه بومی، ولی سویه Sp7 یک سویه ایزوله از برزیل است، می توان گفت استفاده از ایزوله های محلی باکتری به دلیل سازگاری بیشتر با گیاهان و شرایط خاکی منطقه بهتر است. سوادریسکا (۲۰۰۰) طی تحقیقی نشان داد، که تلقیح با باکتری آزوسپریلیوم برازیلنس به واسطه افزایش غلظت کلروفیل، افزایش ۲۷ درصدی عملکرد در گندم و ۶ درصدی در یولاف را سبب می شود.
اردکانی و همکاران (۱۳۷۸) مشخص نمودند که اثر کاربرد آزوسپریلیوم در اکثر صفات مورد بررسی روی گندم، مثبت و معنی دار است ولی با افزایش میزان مصرف کود نیتروژنه، فعالیت باکتری های آزوسپریلیوم در تثبیت بیولوژیکی نیتروژن سریعاً کاهش می یابد. کاپولینگ و همکاران (۱۹۸۱) گزارش کردند که تلقیح گندم (C3) و سورگوم (C4) با آزوسپریلیوم باعث تسریع در ظهور سنبله ها و گلدهی می شود و وزن کل اندام هوایی، وزن کل ریشه، نیتروژن کل، ارتفاع گیاه، طول برگ و تعداد سنبلچه ها در سنبله های گندم را افزایش می دهد. تلقیح نیتروژنوباکتر کروکوکوم و آزوسپریلیوم برازیلنس همراه با کود دامی، رشد، تجمع ماده خشک، تولید دانه و پروتئین را در سورگوم افزایش می دهد (حاجی بلند و همکاران، (۱۳۸۳).
در یک آزمایش میزان نیتروژن دانه گندم، به دنبال استفاده از آزوسپریلیوم برازیلنس، در تیمارهایی که از کود نیتروژنه استفاده نشده بود افزایش یافت. این افزایش احتمالاً ناشی از افزایش جذب نیتروژن بعد از مرحله گلدهی است، بدون اینکه تاثیری در عملکرد دانه داشته باشد (رودریگوز و همکاران، ۲۰۰۰).
در یک بررسی استفاده از مخمر و آزوسپریلیوم روی گندم، تمام صفات رشدی را تحت تأثیری قرار داد، به طوری که از لحاظ عملکرد به جز شاخص برداشت، اختلاف معنی داری بین تیمار شاهد و سایر تیمارها دیده شد. کاربرد آزوسپریلیوم و مخمر تأثیر قابل توجهی روی ارتفاع گیاه، تعداد خوشه در متر مربع، طول خوشه، تعداد دانه در خوشه، وزن هزاردانه، عملکرد دانه، عملکرد کاه و کلش و عملکرد بیولوژیکی داشت (نبیلا و همکاران، ۲۰۰۷).